رنگ‌آمیزی گرم به طور گسترده در میکروبیولوژی استفاده می‌شود، زیرا یکی از ساده‌ترین راه‌ها برای تمایز باکتری‌ها بر اساس ترکیب دیواره سلولی آنهاست. با توجه به گرم، همه باکتری ها را می توان به گرم مثبت (گرم (+)) و گرم منفی (گرم (-) تقسیم کرد. روش رنگ آمیزی گرم در سال 1884 توسعه یافت و از آن زمان تاکنون محبوبیت خود را از دست نداده است، اگرچه چندین بار اصلاح شده است.
ساختار دیواره سلولی
رنگ‌آمیزی گرم نشان می‌دهد که یک باکتری گرم مثبت یا گرم منفی است. تقسیم باکتری ها به گرم (+) و گرم (-) مطابق با ساختار دیواره سلولی آنها انجام می شود.
دیواره سلولی حاوی بیشترین مقدار پپتیدوگلیکان (مورئین) است - یک ماده پیچیده که شامل پپتاپپتید و گلیکان است. گلیکان شامل بقایای متناوب N-acetylglucosamine و N-acetylmuramic acid است که توسط β-1 به یکدیگر مرتبط شده اند.4-پیوندهای گلیکوزیدی پپتیدوگلیکان حفظ شکل سلولی، حفاظت اسمزی و عملکرد آنتی ژنی را فراهم می کند.
تفاوت های اصلی بین باکتری های گرم مثبت و گرم منفی
باکتری های مختلف ضخامت لایه پپتیدوگلیکان متفاوتی دارند. در باکتری هایی که به عنوان گرم مثبت طبقه بندی می شوند، بین 15 تا 80 نانومتر متغیر است، در حالی که در گرم منفی بین 2 تا 8 نانومتر است. در عین حال، باکتری های گرم منفی ساختار خاصی در زیر لایه پپتیدوگلیکان دارند که باکتری های گرم مثبت آن را ندارند - فضای پری پلاسمیک. این فضا با آنزیم های هیدرولیتیک - β-لاکتاماز، ریبونوکلئاز 1، فسفاتاز پر شده است. این آنزیم ها هستند که مسئول مقاومت باکتری های گرم منفی در برابر بسیاری از آنتی بیوتیک ها هستند.
لایه گرم (-) پپتیدوگلیکان باکتری به لیپوپلی ساکارید، یک ساختار آنتی ژنی حاوی اندوتوکسین متصل می شود. در باکتری های گرم (+)، اسیدهای تیکوئیک عملکردهای مشابهی را انجام می دهند.
باکتری های گرم منفی یک ساختار اضافی دارند - غشای خارجی.
جوهر روش رنگ آمیزی
قبل از شروع رنگ آمیزی، اسمیر باکتری های مورد مطالعه تهیه می شود. برای انجام این کار، آب روی یک اسلاید شیشه ای چکه می شود و کشت میکروارگانیسم ها با یک حلقه باکتریایی به آنجا اضافه می شود. سپس، پس از خشک شدن کامل آب، اسمیر ثابت می شود - اسلاید شیشه چندین بار روی شعله مشعل حمل می شود. رنگ‌آمیزی گرم مؤثرتر از رنگ‌آمیزی باکتری‌های زنده است - مولکول‌های رنگ بهتر به سلول‌های مرده متصل می‌شوند.
رنگ‌آمیزی در چند مرحله انجام می‌شود:
- تکه های کوچک کاغذ صافی روی یک اسمیر ثابت قرار می گیرند و رنگ اصلی - بنفش جنتی یا متیلن بلو ریخته می شود.
- بعد از 3-5 دقیقه، کاغذ صافی رنگی را بردارید و اسمیر را با محلول لوگول به مدت 1 دقیقه پر کنید. در این مورد، آماده سازی تیره می شود.
- محلول لوگول تخلیه می شود و اسمیر با الکل اتیل خالص درمان می شود: چند قطره روی آماده سازی می ریزد و پس از 20 ثانیه تخلیه می شود. این روش 2-3 بار تکرار می شود.
- اسلاید آزمایش را با آب مقطر بشویید.
- ایجاد رنگ اضافی - آماده سازی را با فوشسین تمام کنید. پس از 1-2 دقیقه، رنگ شسته می شود.
- پس از خشک شدن آب، اسمیر را زیر میکروسکوپ بررسی کنید. باکتری های گرم مثبت آبی-بنفش، باکتری های گرم منفی صورتی یا قرمز خواهند بود.
علل الگوهای مختلف رنگ‌آمیزی
همانطور که در بالا توضیح داده شد، رنگ آمیزی گرم باکتری ها، باکتری های گرم مثبت را آبی-بنفش می کند، در حالی که باکتری های گرم منفی قرمز یا صورتی رنگ می کنند. دلیل رنگ‌آمیزی افتراقی باکتری‌ها به این روش این است که پس از ورود فرم محلول بنفشه جنسی به سلول، رنگ به شکل ید نامحلول تبدیل می‌شود. در طی درمان باکتری ها با الکل اتیلیک، لیپیدها از غشاء تحت تأثیر این حلال غیر قطبی استخراج می شوند. سپس غشا متخلخل می شود و دیگر مانع قابل توجهی برای شستشوی رنگ نیست. با این حالپپتیدوگلیکان در برابر حلال های غیر قطبی از جمله الکل مقاوم تر است. این اوست که از شستن رنگ جلوگیری می کند، بنابراین باکتری های دارای لایه ضخیم مورئین به رنگ آبی مایل به بنفش (گرم مثبت) تبدیل می شوند و پس از درمان با الکل رنگ خود را تغییر نمی دهند.
لایه نازک مورئین از باکتری های گرم منفی نمی تواند مولکول های رنگ را در سلول نگه دارد، بنابراین پس از اثر الکل بی رنگ می شوند - لکه گرم منفی.
پس از قرار گرفتن در معرض یک اسمیر با فوشسین، باکتری های رنگ آمیزی گرم آبی-بنفش باقی می مانند، در حالی که باکتری های گرم منفی صورتی-قرمز می شوند.
نمونه‌هایی از باکتری‌های گرم(+) و گرم(-)
باکتری های گرم منفی شامل سیانوباکتری ها، باکتری های گوگرد، باکتری های آهن، کلامیدیا، ریکتزیا، باکتری های استیک، بسیاری از متیلوباکتری ها، باکتری های تیونیک، آرسنیتوباکتری ها، کربوکسی باکتری ها هستند.
بیفیدوباکتری ها، بسیاری از باکتری های آبزی، استرپتوکوک ها و استافیلوکوک ها گرم مثبت هستند.
