جذب و انتشار مجدد نور توسط محیط های معدنی و آلی نتیجه فسفرسانس یا فلورسانس است. تفاوت بین پدیده ها در طول فاصله بین جذب نور و انتشار جریان است. با فلورسانس، این فرآیندها تقریباً به طور همزمان و با فسفرسانس با مقداری تاخیر اتفاق می‌افتند.
پیشینه تاریخی
در سال 1852، دانشمند بریتانیایی استوکس برای اولین بار فلورسانس را توصیف کرد. او اصطلاح جدید را در نتیجه آزمایش‌های خود با فلورسپار ابداع کرد که در معرض نور ماوراء بنفش نور قرمز ساطع می‌کرد. استوکس به یک پدیده جالب توجه کرد. او دریافت که طول موج نور فلورسنت همیشه بیشتر از طول موج نور تحریک است.
آزمایش های بسیاری در قرن نوزدهم برای تایید این فرضیه انجام شد. آنها نشان دادند که نمونه های مختلفی در معرض نور فرابنفش فلورسانس می شوند. مواد شامل کریستال ها، رزین ها، مواد معدنی، کلروفیل،مواد اولیه دارویی، ترکیبات معدنی، ویتامین ها، روغن ها. استفاده مستقیم از رنگها برای تجزیه و تحلیل بیولوژیکی تنها در سال 1930 آغاز شد
شرح میکروسکوپ فلورسانس
برخی از مواد مورد استفاده در تحقیقات در نیمه اول قرن بیستم بسیار خاص بودند. به لطف شاخص هایی که نمی توان با روش های کنتراست به دست آورد، روش میکروسکوپ فلورسانس به یک ابزار مهم در تحقیقات زیست پزشکی و بیولوژیکی تبدیل شده است. نتایج به‌دست‌آمده برای علم مواد اهمیت چندانی نداشتند.
فواید میکروسکوپ فلورسانس چیست؟ با کمک مواد جدید، جداسازی سلول های بسیار خاص و اجزای زیر میکروسکوپی امکان پذیر شد. یک میکروسکوپ فلورسنت به شما امکان می دهد تک تک مولکول ها را تشخیص دهید. انواع رنگ ها به شما امکان می دهد چندین عنصر را همزمان شناسایی کنید. اگرچه وضوح مکانی تجهیزات توسط حد پراش محدود می شود که به نوبه خود به ویژگی های خاص نمونه بستگی دارد، تشخیص مولکول های زیر این سطح نیز کاملاً امکان پذیر است. نمونه های مختلف پس از تابش، اتوفلورسانس را نشان می دهند. این پدیده به طور گسترده در سنگ شناسی، گیاه شناسی، صنایع نیمه هادی استفاده می شود.
ویژگی ها
مطالعه بافت‌های حیوانی یا میکروارگانیسم‌های بیماری‌زا اغلب با اتوفلورسانس غیراختصاصی خیلی ضعیف یا بسیار قوی پیچیده می‌شود. با این حال، ارزش درتحقیقات مقدمه ای به مواد اجزایی است که در طول موج خاصی برانگیخته شده و شار نوری با شدت مورد نیاز ساطع می کنند. فلوروکروم ها به عنوان رنگ هایی عمل می کنند که قادر به اتصال خود به ساختارها (نامرئی یا قابل مشاهده) هستند. در عین حال، آنها با گزینش پذیری بالا نسبت به اهداف و بازده کوانتومی متمایز می شوند.
میکروسکوپ فلورسانس با ظهور رنگ های طبیعی و مصنوعی به طور گسترده ای مورد استفاده قرار گرفته است. آنها پروفایل های شدت انتشار و تحریک خاصی داشتند و اهداف بیولوژیکی خاصی را هدف قرار می دادند.
شناسایی تک تک مولکولها
اغلب، در شرایط ایده آل، می توانید درخشش یک عنصر را ثبت کنید. برای انجام این کار، از جمله موارد دیگر، لازم است از نویز آشکارساز و پس زمینه نوری به اندازه کافی کم اطمینان حاصل شود. یک مولکول فلورسین می تواند تا 300000 فوتون قبل از تخریب به دلیل سفید شدن نور از خود ساطع کند. با نرخ جمع آوری 20% و راندمان فرآیند، می توان آنها را به مبلغ حدود 60 هزار
ثبت کرد.
میکروسکوپ فلورسانس، بر اساس فتودیودهای بهمن یا ضرب الکترون، به محققان این امکان را داد که رفتار تک تک مولکولها را برای چند ثانیه و در برخی موارد چند دقیقه مشاهده کنند.
مشکلات
مشکل اصلی سرکوب نویز از پس زمینه نوری است. با توجه به اینکه بسیاری از مواد به کار رفته در ساخت فیلترها و عدسی ها مقداری خودفلورسانس از خود نشان می دهند، تلاش دانشمندان در مراحل اولیه معطوف به صدور بود.اجزای با فلورسانس کم با این حال، آزمایش های بعدی به نتایج جدیدی منجر شد. به طور خاص، میکروسکوپ فلورسانس بر اساس بازتاب داخلی کل برای دستیابی به پس زمینه کم و خروجی نور با تحریک بالا یافت شده است.
مکانیسم
اصول میکروسکوپ فلورسانس بر اساس بازتاب داخلی کل، استفاده از موجی است که به سرعت در حال پوسیدگی یا غیرقابل انتشار است. در حد فاصل بین رسانه‌هایی با ضریب شکست مختلف ایجاد می‌شود. در این حالت پرتو نور از یک منشور عبور می کند. ضریب شکست بالایی دارد.
منشور مجاور یک محلول آبی یا شیشه با پارامتر پایین است. اگر پرتو نور با زاویه ای بیشتر از زاویه بحرانی به سمت آن هدایت شود، پرتو به طور کامل از سطح مشترک منعکس می شود. این پدیده به نوبه خود موجی غیرقابل انتشار را ایجاد می کند. به عبارت دیگر، میدان الکترومغناطیسی ایجاد می‌شود که به محیطی با ضریب شکست کمتر در فاصله کمتر از 200 نانومتر نفوذ می‌کند.
در یک موج غیرقابل انتشار، شدت نور برای تحریک فلوروفورها کاملاً کافی است. با این حال، به دلیل عمق بسیار کم، حجم آن بسیار کم خواهد بود. نتیجه یک پس‌زمینه سطح پایین است.
تغییر
میکروسکوپ فلورسانس بر اساس انعکاس کلی داخلی را می توان با اپی روشنایی متوجه شد.این به لنزهایی با دیافراگم عددی افزایش یافته (حداقل 1.4، اما مطلوب است که به 1.45-1.6 برسد) و همچنین میدان تا حدی روشن دستگاه نیاز دارد. دومی با یک نقطه کوچک به دست می آید. برای یکنواختی بیشتر، از یک حلقه نازک استفاده می شود که از طریق آن بخشی از جریان مسدود می شود. برای به دست آوردن یک زاویه بحرانی که پس از آن بازتاب کامل رخ می دهد، سطح بالایی از شکست محیط غوطه وری در عدسی ها و شیشه پوشش میکروسکوپ مورد نیاز است.
