روش های تحقیق بیولوژیکی مولکولی نقش بزرگی در پزشکی مدرن، پزشکی قانونی و زیست شناسی ایفا می کند. به لطف پیشرفت در مطالعه DNA و RNA، فرد قادر است ژنوم یک موجود زنده را مطالعه کند، عامل بیماری را تعیین کند، اسید نوکلئیک مورد نظر را در مخلوطی از اسیدها تشخیص دهد و غیره.
روشهای تحقیق بیولوژیکی مولکولی. چیست؟
در دهه 70 و 80 میلادی، دانشمندان برای اولین بار موفق به رمزگشایی ژنوم انسان شدند. این رویداد انگیزه ای برای توسعه مهندسی ژنتیک و زیست شناسی مولکولی ایجاد کرد. مطالعه خواص DNA و RNA به این واقعیت منجر شده است که اکنون می توان از این اسیدهای نوکلئیک برای تشخیص بیماری، مطالعه ژن ها استفاده کرد.
به دست آوردن DNA و RNA
روشهای تشخیصی بیولوژیکی مولکولی نیاز به حضور ماده اولیه دارند: بیشتر اوقات این اسیدهای نوکلئیک هستند. راه های مختلفی برای جداسازی این مواد از سلول های موجودات زنده وجود دارد. هر کدام از آنها مزایا و معایب خاص خود را دارند و لازم استهنگام انتخاب روشی برای جداسازی اسیدهای نوکلئیک خالص را در نظر بگیرید.
1. به دست آوردن DNA بر اساس Marmur. این روش شامل درمان مخلوطی از مواد با الکل است که در نتیجه DNA خالص رسوب می کند. عیب این روش استفاده از مواد تهاجمی مانند فنل و کلروفرم است.
2. جداسازی DNA بر اساس بوم. ماده اصلی مورد استفاده در اینجا گوانیدین تیوسیانات (GuSCN) است. این به رسوب اسید دئوکسی ریبونوکلئیک بر روی بسترهای تخصصی کمک می کند، که متعاقباً می توان آن را با استفاده از یک بافر مخصوص جمع آوری کرد. با این حال، GuSCN یک مهارکننده PTC است و حتی قسمت کوچکی از آن که وارد DNA رسوب شده می‌شود، می‌تواند بر روند واکنش زنجیره‌ای پلیمراز تأثیر بگذارد، که نقش مهمی در کار با اسیدهای نوکلئیک دارد.
3. ته نشین شدن ناخالصی ها. این روش با روش های قبلی متفاوت است زیرا مولکول های اسید دئوکسی ریبونوکلئیک نیستند، بلکه ناخالصی ها هستند. برای این کار از مبدل های یونی استفاده می شود. عیب آن این است که همه مواد نمی توانند رسوب کنند.
4. غربالگری انبوه از این روش در مواردی استفاده می شود که اطلاعات دقیقی در مورد ترکیب مولکول DNA مورد نیاز نیست، اما به دست آوردن برخی داده های آماری ضروری است. این با این واقعیت توضیح داده می شود که ساختار اسید نوکلئیک می تواند در هنگام درمان با مواد شوینده، به ویژه مواد قلیایی، آسیب ببیند.
طبقه بندی روش های تحقیق
همه روش های تحقیق بیولوژیکی مولکولی به سه گروه بزرگ تقسیم می شوند:
1. تقویت (با استفاده از آنزیم های زیادی). اینجابه واکنش زنجیره ای پلیمراز - PCR اشاره دارد که نقش زیادی در بسیاری از روش های تشخیصی دارد.
2. غیر تقویت کننده این گروه از روش ها به طور مستقیم با عملکرد مخلوط اسیدهای نوکلئیک مرتبط است. مثلاً 3 بلات، هیبریداسیون درجا، و غیره.
3. روش‌هایی مبتنی بر تشخیص سیگنال از یک مولکول پروبی که به DNA یا RNA پروب خاصی متصل می‌شود. یک مثال سیستم ضبط هیبریدی (hc2) است.
آنزیم هایی که می توانند در روش های تحقیقاتی زیست شناسی مولکولی استفاده شوند
بسیاری از روش های تشخیصی مولکولی شامل استفاده از طیف وسیعی از آنزیم ها است. در زیر متداول ترین موارد استفاده شده است:
1. آنزیم محدود کننده - مولکول DNA را به قسمت های ضروری "برش" می دهد.
2. DNA پلیمراز - یک مولکول دو رشته ای اسید دئوکسی ریبونوکلئیک را سنتز می کند.
3. رونوشت معکوس (ریورتاز) - برای سنتز DNA روی یک الگوی RNA استفاده می شود.
4. DNA لیگاز - مسئول تشکیل پیوندهای فسفودی استر بین نوکلئوتیدها است.
5. اگزونوکلئاز - نوکلئوتیدها را از بخش های انتهایی مولکول اسید دئوکسی ریبونوکلئیک حذف می کند.
PCR روش اصلی تکثیر DNA است
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) به طور فعال در زیست شناسی مولکولی مدرن استفاده می شود. این روشی است که در آن می توان تعداد زیادی کپی از یک مولکول DNA به دست آورد (مولکول ها تقویت می شوند).
عملکردهای اصلی PCR:
- تشخیصبیماری ها؛
- شبیه‌سازی بخش‌های DNA، ژن‌ها.
عناصر زیر برای انجام یک واکنش زنجیره ای پلیمراز مورد نیاز هستند: مولکول DNA اولیه، یک DNA پلیمراز پایدار در برابر حرارت (Taq یا Pfu)، فسفات های دئوکسی ریبونوکلئوتید (منابع بازهای نیتروژنی)، آغازگرها (2 آغازگر در هر یک مولکول DNA).) و خود سیستم بافر، که در آن همه واکنش ها ممکن است.
PCR شامل سه مرحله است: دناتوراسیون، بازپخت پرایمر و ازدیاد طول.
1. دناتوره سازی. در دمای 94-95 درجه سانتیگراد پیوندهای هیدروژنی بین دو رشته DNA شکسته می شود و در نتیجه دو مولکول تک رشته ای بدست می آید.
2. آنیل پرایمر. در دمای 60-50 درجه سانتیگراد، پرایمرها از نظر نوع مکمل به انتهای مولکولهای اسید نوکلئیک تک رشته ای متصل می شوند.
3. ازدیاد طول. در دمای 72 درجه، سنتز مولکول های دختر دو رشته ای اسید دئوکسی ریبونوکلئیک رخ می دهد.
توالی‌یابی DNA
روشهای تحقیق بیولوژیکی مولکولی اغلب به دانش توالی نوکلئوتیدی در یک مولکول اسید دئوکسی ریبونوکلئیک نیاز دارند. توالی یابی برای تعیین کد ژنتیکی انجام می شود. تشخیص مولکولی آینده بر اساس دانش به دست آمده از توالی یابی انسانی خواهد بود.
انواع زیر از ترتیب بندی متمایز می شوند:
- توالی ماکسام-گیلبرت؛
- سکانس سانجر؛
- pyrosequencing;
- نانو منافذتوالی.
