کشت باکتری: روش ها، اصول، مراحل و شرایط

2024 نویسنده: Angel Austin | [email protected]. آخرین اصلاح شده: 2023-12-17 05:24

میکروارگانیسم‌های موجود در طبیعت اطراف ما همه جا هستند: در خاک، بدنه‌های آبی، روی سطوح اجسام مختلف، انسان‌ها و حیوانات توسط آنها زندگی می‌کنند. همه اینها می تواند به عنوان منبع آلودگی میکروبی مواد غذایی، داروها و خطوط تولید باشد. کشت باکتری ها برای مطالعه خواص، نیازها و ویژگی های آنها ضروری است. این به نوبه خود گام مهمی در توسعه داروهای مختلف، تشخیص آزمایشگاهی بیماری‌ها، محاسبه راکتورهای تولید و موارد دیگر است.

مفاهیم کلی

کشت باکتری در میکروبیولوژی به کشت میکروارگانیسم ها در آزمایشگاه اطلاق می شود. به نوبه خود، میکروب هایی که روی یک محیط غذایی انتخاب شده رشد کرده اند، کشت نامیده می شوند. اگر کشت ها توسط انواع مختلف میکروارگانیسم ها تشکیل شده باشند، می توانند مخلوط شوند، و اگر تنها توسط یک نوع باکتری نشان داده شوند، خالص هستند.

اگر مغذی استفقط یک سلول در محیط قرار می گیرد و گروهی از افراد در نتیجه تولید مثل آن به دست می آیند، سپس این مجموعه از میکروارگانیسم ها را کلون می نامند. هنگامی که یک کلون به حدی رشد می کند که با چشم غیرمسلح قابل مشاهده باشد، به این مجموعه از باکتری ها کلنی می گویند.

معمولاً کشت باکتری های جدا شده از منابع مختلف جدا از یکدیگر انجام می شود. هر یک از این دسته از میکروب ها که به طور جداگانه رشد می کنند یک سویه نامیده می شود. بنابراین، اگر یک نوع استافیلوکوک از سه منبع (یا بخش‌های مختلف از یک محصول، افراد مختلف) جدا شود، در مورد سه سویه از این نوع استافیلوکوک صحبت می‌شود.

عوامل رشد باکتری

اینها شامل اسیدهای آمینه مختلف، لیپیدها، بازهای پورینی و سایر ترکیبات ضروری برای رشد میکروارگانیسم ها هستند. برخی از میکروب ها می توانند به طور مستقل مواد مورد نیاز خود را تولید کنند، در حالی که برخی دیگر باید آنها را به شکل نهایی دریافت کنند. با توجه به نیاز میکروارگانیسم ها به فاکتورهای رشد خاص، شناسایی و تمایز باکتری ها انجام می شود. همچنین، این پارامتر برای تهیه صحیح یک محیط غذایی برای کارهای آزمایشگاهی و بیوتکنولوژیکی مهم است:

اسیدهای آمینه. باکتری ها ممکن است به یک اسید آمینه خاص یا گروهی از اسیدها نیاز داشته باشند. بنابراین، کلستریدیا به لوسین و تیروزین، استرپتوکوک ها به لوسین و آرژنین نیاز دارند. میکروارگانیسم هایی که برای رشد به اسیدهای آمینه از خارج نیاز دارند، اکسوتروف نامیده می شوند.
بازهای پورین و پیریمیدین و همچنین مشتقات آنها (آدنین، گوانین و غیره). آنها عامل مهمی در رشد بسیاری هستندگونه های استرپتوکوک.
ویتامین ها. آنها بخشی از کوآنزیم های مورد نیاز باکتری ها هستند. بنابراین، اسید نیکوتین و همچنین آمید آن، که بخشی از NAD و NADP هستند، مورد نیاز باکتری‌های دیفتری و شیگلا کورینه است. تیامین، به عنوان بخشی جدایی ناپذیر از پیروفسفات، مورد نیاز استافیلوکوکوس اورئوس، پنوموکوک، بروسلا است. اسید پانتوتنیک، که بخشی از کوآنزیم CoA است، توسط باسیل‌های کزاز و انواع خاصی از استرپتوکوک مورد نیاز است. سیتوکروم ها و بنابراین اسید فولیک، هم ها و بیوتین که آنها را تشکیل می دهند، برای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و هموفیلوس آنفولانزا ضروری هستند.

الزامات محیطی

شرایط محیط کشت برای کشت باکتری:

تغذیه. علاوه بر این، آنها باید حاوی موادی باشند که به راحتی قابل هضم هستند، که برای تغذیه و تجدید انرژی میکروارگانیسم ها ضروری است. این شامل ارگانوژن ها و مواد معدنی است. برخی از میکروارگانیسم‌ها به ویتامین‌ها و اسیدهای آمینه نیز نیاز دارند که نمی‌توانند آن‌ها را سنتز کنند.
سطح pH بهینه. بر نفوذپذیری غشای سلولی و بر این اساس، توانایی جذب مواد مغذی توسط باکتری تأثیر می گذارد. اغلب، مقدار pH باید در سطح 7، 2-7، 4 باشد. بسیاری از میکروارگانیسم ها در طول زندگی خود محصولاتی با واکنش های اسیدی یا قلیایی تولید می کنند، و برای اینکه pH محیط غذایی تغییر نکند، باید بافر شود.
ایزوتونیک. فشار اسمزی در محیط غذایی برای کشت باکتری باید همان مقادیر باشدداخل سلول های میکروبی معمولاً مربوط به محلول 0.5% NaCl است.
عقیمی. این به دلیل این واقعیت است که ظاهر باکتری های خارجی نتایج مطالعه سویه مورد تجزیه و تحلیل را مخدوش می کند.
سطح رطوبت. این شاخص، همراه با قوام محیط، باید ویژگی های بهینه ای برای نوع خاصی از باکتری داشته باشد.
پتانسیل ردوکس (RH2). نسبت مواد اهداکننده و پذیرش الکترون و همچنین میزان اشباع اکسیژن محیط غذایی را نشان می دهد. برای هوازی و بی هوازی، شرایط کشت باکتری در این شاخص تا حدودی متفاوت است. میکروارگانیسم های بی هوازی در مقادیر RH2 زیر 5 و میکروارگانیسم های هوازی حداقل 10 بهترین تولید مثل می کنند.
یکنواختی. مهم است که محیط کشت حاوی مقادیر ثابتی از مواد تشکیل دهنده خود باشد. علاوه بر این، محلول‌های شفاف ترجیح داده می‌شوند که نظارت بر رشد محصول یا مشاهده آلودگی را آسان‌تر می‌کنند.

انواع محیط کشت

انتخاب یک محیط خاص برای رشد میکروارگانیسم ها تحت تأثیر عوامل زیادی است که از جمله آنها می توان به ویژگی های تغذیه آنها و هدف مطالعه اشاره کرد. ویژگی های اصلی طبقه بندی محیط های غذایی عبارتند از:

1. اجزاء. با توجه به مواد اولیه مورد استفاده برای ایجاد بستر، آنها متمایز می شوند:

طبیعی که از محصولات با منشاء حیوانی یا گیاهی (مانند گوشت، شیر، میوه) تهیه شده و برای رشد مخلوط مناسب است.محصولات زراعی؛
نیمه مصنوعی، که در آن محصولات غذایی طبیعی گران قیمت با محصولات غیر غذایی (به عنوان مثال، پودر استخوان، لخته شدن خون) جایگزین می شوند و برای کشت انواع خاصی از باکتری ها یا جداسازی محصولات متابولیک آنها از محیط زیست؛
سنتتیک که از مقادیر دقیق ترکیبات شیمیایی تهیه می شود، دارای ترکیب ثابت شناخته شده ای است و به راحتی قابل تکرار است.

2. قوام (تراکم). متمایز کردن محیط ها:

مایع;
متراکم;
نیمه مایع.

دو مورد آخر از محلول های مخصوص یا مواد مایع با افزودن آگار آگار یا ژلاتین برای ایجاد تراکم لازم تهیه می شود. علاوه بر این، یک محیط متراکم برای رشد باکتری ها سرم خون لخته شده، سیب زمینی، سیلیکاژل، کاراگینان است.

3. ترکیب. بر این اساس، محیط ها عبارتند از:

ساده، که فهرست آن کوتاه است، براث پپتون گوشت (MBB)، آبگوشت و آگار هاتینگر، پپتون آگار گوشت (MPA)، ژلاتین مغذی و آب پپتون.
کمپلکس، تهیه شده از انواع ساده با افزودن خون، آب پنیر، کربوهیدرات ها و مواد دیگر.

4. وقت ملاقات. مواد مغذی زیر متمایز می شوند:

اصلی برای رشد بسیاری از میکروب های بیماری زا (معمولاً ترکیبات ساده) استفاده می شود؛
های ویژه برای جداسازی و کشت باکتری هایی که روی بسترهای ساده رشد نمی کنند استفاده می شود؛
انتخابی (آنها نیز انتخابی هستند) برای جداسازی نوع خاصی از باکتری ها مناسب هستند و رشد میکروب های مرتبط را مهار می کنند (انتخاب پذیری).ایجاد شده با افزودن برخی مواد به محیط، مانند آنتی بیوتیک ها یا نمک ها، یا با تنظیم pH؛
تشخیص افتراقی با ارزیابی فعالیت آنزیمی، به عنوان مثال، محیط کشت، تشخیص یک نوع باکتری از دیگری را ممکن می سازد.
مواد نگهدارنده برای تلقیح اولیه با حمل و نقل بعدی نمونه ها مورد نیاز است، زیرا از مرگ میکروارگانیسم ها جلوگیری می کند و همچنین از رشد سایر باکتری ها جلوگیری می کند.

آماده سازی رسانه

مهمترین مرحله در پرورش باکتری های بی هوازی تهیه یک محیط غذایی مناسب است. پس از انتخاب پارامترهای بهینه، به مراحل زیر بروید:

توزین، با انتخاب نمونه ای از اجزا در ترازوی تحلیلی؛
انحلال در آب مقطر گرم شده تا 70 درجه سانتیگراد انجام می شود و فسفات ها، میکرونمک ها و ماکرو نمک ها به طور جداگانه حل می شوند؛
جوشاندن در حمام آب به مدت دو دقیقه؛
تعیین pH با کاغذ نشانگر یا پتانسیومتر؛
فیلتراسیون از طریق فیلترهای پارچه ای یا کاغذی مرطوب برای محیط های مایع و همچنین مذاب متراکم، و از طریق فیلتر پنبه ای برای محیط آگار؛
بطری‌سازی با ظرفیت 3/4 انجام شد؛
استریلیزاسیون وابسته متوسط؛
کنترل عقیمی با ته نشین شدن به مدت دو روز در ترموستات و سپس مشاهده انجام می شود؛
کنترل شیمیایی برای ایجاد pH و محتوای لازمموارد;
کنترل بیولوژیکی با تلقیح آزمایشی.

استریل کردن ظروف شیشه ای و رسانه

یکی از اصول اساسی کشت باکتری عقیمی است. رشد و توسعه میکروارگانیسم‌های خارجی می‌تواند با تغییر ترکیب شیمیایی و pH بر ویژگی‌های محیط غذایی تأثیر بگذارد. عقیم سازی شرط اصلی رشد کشت های خالص است. در عمل، این اصطلاح به معنای روش های تخریب مطلقاً تمام اشکال حیات در سطح و در حجم اشیاء استریل شده است. رگ‌ها، وسایل مورد استفاده، رسانه‌ها و سایر موارد مورد استفاده در طول مطالعه استریل می‌شوند.

برخی از انواع عقیم سازی:

اشتعال. عقیم سازی حلقه ها و سوزن ها برای کاشت، اسلایدهای شیشه ای، برخی ابزارها را می توان با استفاده از مشعل یا لامپ روح انجام داد.
جوش. مناسب برای دست زدن به سرنگ، سوزن، غذا، اما اسپورهای باکتریایی را از بین نمی برد.
استریلیزاسیون با حرارت خشک. این در یک کابینت خشک کن مخصوص انجام می شود و برای پردازش فلاسک ها، لوله های آزمایش و سایر ظروف شیشه ای آزمایشگاهی مناسب است.
استریلیزاسیون با بخار. این روش که در اتوکلاو انجام می شود بسیار موثر است. اما برای محیط های غذایی حاوی پروتئین یا هر ترکیب دیگری که در دمای بالا تجزیه می شود، مناسب نیست. صرفه جویی بیشتر را می توان tyndalization نامید. در دیگ کوخ انجام می شود و جوانه زنی هاگ ها را با تخریب آنها ترکیب می کند.
پاستوریزه کردن. برای رسانه هایی استفاده می شود که خواص خود را هنگام جوشاندن تغییر می دهند (به عنوان مثال، شیر، شراب، آبجو)آنها را از شر میکروارگانیسم های غیر اسپور خلاص کنید. دمای پردازش فقط 50-60 درجه سانتیگراد برای پانزده تا سی دقیقه است. در برخی موارد، استریلیزاسیون سرد استفاده می شود که با استفاده از فیلترها یا اشعه ماوراء بنفش انجام می شود.

شرایط کشت باکتری

رشد و توسعه باکتری ها تنها تحت عوامل خاصی و مقادیر هر یک از آنها امکان پذیر است:

1. درجه حرارت. سه گروه از باکتری ها وجود دارند که در ترجیحات دما متفاوت هستند:

ترموفیل ها یا میکروب های گرما دوست در دمای 90-45 درجه سانتیگراد رشد می کنند، به این معنی که در موجودات انسانی و حیوانی تکثیر نمی شوند؛
روان دوست ها یا میکروارگانیسم های سرما دوست، دمای بین 5 تا 15 درجه سانتیگراد را ترجیح می دهند و در سردخانه ها رشد می کنند؛
مزوفیل، در دمای 25-37 درجه سانتیگراد ایجاد می شوند، آنها شامل بخش عمده ای از باکتری ها هستند.

2. سبک. این یکی از ویژگی های کشت باکتری های فوتوتروف است، زیرا آنها فرآیند فتوسنتز را انجام می دهند. اما برای اکثر میکروب ها، روشنایی یک پیش نیاز نیست. و حتی بالعکس، اشعه ماوراء بنفش خورشیدی می تواند رشد آنها را سرکوب کند.

3. اب. همه میکروارگانیسم ها به آب به شکل قابل دسترس (مایع) نیاز دارند. به همین دلیل است که مواد غذایی منجمد رشد کمی یا بدون رشد باکتری دارند.

4. اسیدیته محیط این اصل کشت باکتری قبلاً به تفصیل در بالا مورد بحث قرار گرفته است.

5. هوادهی. اکسیژن به عنوان یک عنصر شیمیایی جزء لاینفک آب و تعداد قابل توجهی از ترکیبات مورد استفاده برایکشت میکروارگانیسم ها اکسیژن گازی نیز می تواند در آب و سایر مایعات به صورت محلول موجود باشد. بخش قابل توجهی از باکتری ها نیاز به تامین مداوم مولکول های اکسیژن دارند. اما برای تعدادی از میکروارگانیسم ها، غیر ضروری است، یا بدتر از آن، اکسیژن گازی برای آنها سمی است، زیرا آنها کاتالاز و پراکسیداز ندارند، که محصولات سمی تنفسی را از بین می برد. بنابراین مهم ترین مرحله در کشت باکتری های بی هوازی حذف مولکول های O₂ از محیط غذایی است.

6. پرورش میکروارگانیسم ها. کشت باکتری های هوازی و بی هوازی در لایه های مختلف محیط و در حالت های مختلف انجام می شود.

کشت میکروارگانیسم های هوازی

کشت باکتری های هوازی به اکسیژن مولکولی نیاز دارد. برای به دست آوردن کشت خالص هوازی که می تواند با موفقیت در پزشکی و صنایع غذایی استفاده شود، از روش های زیر استفاده می شود:

سطح رشد بر روی محیط های متراکم یا در محیط های مایع (لایه نازک آنها) زمانی که اکسیژن مستقیماً از هوا می آید؛
کشت عمیق در محیط های مایع، زمانی که افزایش مقدار اکسیژن محلول در آنها با هوادهی ثابت حاصل شود.

کشت میکروارگانیسم های بی هوازی

اصل اساسی پرورش باکتری از این نوع حداقل تماس آنها با اکسیژن اتمسفر است. فراهم کردن شرایط برای رشد آنها بسیار دشوارتر از هوازی است. روش های زیر برای جداسازی بی هوازی ها از O₂ استفاده می شود:

فیزیکی. این روش کشت باکتری های بی هوازی به کشت آنها در دستگاه خلاء ویژه - میکروآنرواستات کاهش می یابد. هوای موجود در آن با مخلوط گاز خاصی از نیتروژن با افزودن 10٪ هیدروژن و 5٪ دی اکسید کربن جایگزین می شود.
شیمیایی. این موارد عبارتند از: استفاده از عوامل جاذب (مانند Fe، Na₂S₂O₄، CuCl) یا عوامل کاهنده (مانند اسید اسکوربیک).
بیولوژیکی. این به کشت مشترک هوازی و بی هوازی در یک سیستم بسته می رسد. این روش کشت باکتری شامل کاشت نیمی از ظرف پتری با برخی از گونه های هوازی باکتری و نیمی دیگر با بی هوازی مورد مطالعه است. توسعه آن در لحظه ای آغاز می شود که تمام اکسیژن مصرف شود.

روش های کاشت زیر برای کشت باکتری های بی هوازی مناسب است:

در لایه سطحی؛
در لایه سطحی پر شده با پارافین استریل؛
در ضخامت یک محیط مغذی متراکم؛
در لایه های عمیق محیط های چسبناک.

به دست آوردن فرهنگ ناب

میکروبیولوژیست ها معمولاً با نمونه هایی کار می کنند که انواع مختلفی از میکروب ها در آنها زندگی می کنند. با این حال، برای تعیین موقعیت سیستماتیک میکروارگانیسم ها (خانواده، جنس، گونه)، و همچنین مطالعه ویژگی های آنها، جداسازی آنها و رشد یک فرهنگ خالص ضروری است. آنها در بسیاری از صنایع غذایی مانند پنیر، نان، کواس، شراب و غیره اهمیت زیادی دارند. کشت باکتری های اسید لاکتیک امکان به دست آوردن آنها را فراهم می کند.یک جزء ضروری برای تولید محصولات شیر تخمیر شده، خمیر، کاکائو، سیلو و حتی پلاستیک است.

روش جداسازی یک کشت خالص در یک محیط متراکم بر اساس جداسازی مکانیکی سلول‌های میکروارگانیسم با کشت جدا شده بعدی آنها است. نمونه به حجم استریل آب یا نمک (حجم 100-10 میلی لیتر) منتقل می شود و سپس به مدت دو دقیقه تکان داده می شود. به منظور استخراج میکروارگانیسم های واقع در ضخامت ماده مورد مطالعه (مثلاً سوسیس یا کالباس)، ابتدا مالش قطعات نمونه با ابزار استریل با ماسه انجام می شود. موادی که تحت آماده سازی اولیه قرار گرفته اند، به وزن 1 گرم یا حجم 1 میلی لیتر، با آب استریل 10، 100، 1000 و غیره بار رقیق می شوند. درجه رقت انتخاب می شود که غلظت سلول ها را مطابق با قابلیت های روش می دهد.

کشت بعدی میکروارگانیسم ها برای تهیه یک محیط غذایی است. معمولا یک محیط متراکم (MPA) انتخاب می شود. ابتدا ذوب می شود و تا دمای 50-45 درجه سانتیگراد خنک می شود و تنها پس از آن در چندین ظروف پتری (سه تا پنج قطعه) ریخته می شود که در کف آن سواب هایی از ماده آزمایش با غلظت های مختلف قرار می گیرد. در مرحله بعد، اختلاط محیط مغذی هنوز منجمد نشده و مواد وارد شده به آن انجام می شود. به این ترتیب سلول ها در نقاط مختلف حجم زیرلایه ثابت می شوند.

بعد، ظروف پتری به مدت 2 روز در ترموستات در دمای 22 درجه سانتیگراد قرار می گیرند. در این مدت سلول ها به حدی تکثیر می شوند که کلنی تشکیل شده توسط هر یک از سلول ها با چشم غیر مسلح قابل مشاهده می شود. هر یک از آنها یک کشت خالص از نوع باکتری است که از سلول های آن استگل رز.

پس از آن، از ظروف پتری، میکروارگانیسم ها در لوله های آزمایش جداگانه پر از یک محیط غذایی زیر کشت می شوند. به این ترتیب کشت های خالص از یک نمونه مخلوط جداسازی می شوند. این روش نام توسعه دهنده خود را دارد - R. Koch. معمولاً به آن روش فنجانی یا کاشت تهی‌کننده نیز می‌گویند. پس از كشت خالص انواع مختلف باكتري ها، شكل، هاگ و خانواده آنها مشخص مي شود.

همه کارها باید بر اساس اصول آسپسیس انجام شود. برای جلوگیری از رشد زودرس میکروارگانیسم ها، مطالعه باید بلافاصله پس از نمونه برداری انجام شود. آب لوله کشی پس از تخلیه اولین قسمت ها تجزیه و تحلیل می شود، زیرا ممکن است حاوی میکروب های انباشته شده در لوله ها و شیرها باشد. میکرو فلور میوه ها، انواع توت ها و سبزیجات عمدتاً در سطح (پوست) قرار دارد، بنابراین شستشوها از آن انجام می شود. برای این کار، جنین را در یک ظرف استریل قرار دهید و آن را با مقدار مورد نیاز آب پر کنید. سپس به شدت تکان داده شده و آب در ظرف دیگری ریخته می شود. محصولات حاصل از محصولات پارچه ای نیز به صورت سواب بدست می آیند، اما قبل از آن، قطعاتی با اندازه مشخص از آنها بریده می شوند.